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COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS MARINOS DEL INSTITUTO DE
OCEANOLOGÍA
Ortiz, E.; Morales, G., Graña L., Núñez R., Fonseca E, Pizarro, R.; Martínez, C. Díaz Y.
Instituto de Oceanología (CITMA)
Calle 1ra No. 18406 entre 184 y 186. Reparto Flores. Playa Ciudad de la Habana, Cuba.
Telef: 2711380, 2710300. fax: 339112. E-mail: CEBIMAR@infomed.sld.cu
INTRODUCCIÓN
La necesidad de la conservación, identificación, evaluación e información de recursos
microbianos está estrechamente relacionada con los beneficios que las colecciones de
microorganismos generan. Sin embargo existen evidencias de un enorme reservorio de
microorganismos viables, aún no cultivados (Colwell y cols., 1996; Ward y cols., 1996).
Las colecciones ‘ex-situ’ constituyen la única vía práctica de acceso al archivo de material
microbiano con que cuentan las comunidades científica e industrial. En ellas se depositan
cultivos por innumerables razones, para asegurar la perpetuación y reproducibilidad de los
resultados de las investigaciones (Cimerman y Gunde-Cimerman, 1996); conservar cultivos
tipo y de referencia necesarios para los estudios taxonómicos y de control de la calidad
(Cimerman y Gunde-Cimerman, 1996); mantenimiento de las propiedades esenciales de las
cepas de uso industrial; propósitos de patentes (Weihs y Fritze, 1995 y WIPO, 1997; Fritze,
1998) y como herramientas valiosas en programas de conservación y restauración
(Hawksworth, 1994).
Las alteraciones, fragmentación o pérdida de hábitat, ecosistemas y paisajes; la sobre –
explotación de especies; la contaminación de suelos, agua y aire; la invasión o introducción
de especies; y la erosión de los suelos son las principales amenazas para la diversidad
biológica en Cuba (CIGEA, 1999), no sólo para los animales y las plantas, sino también para
los microorganismos.
En el Informe de la Situación Ambiental Cubana – 1998 (CIGEA, 1999) se ofrece una
panorámica del estado de la diversidad biológica. Sin embargo, no se hace referencia alguna
a los microorganismos. Esto demuestra el desconocimiento que existe sobre tales recursos
genéticos y de su incuestionable importancia como componentes esenciales de la
biodiversidad.
Preguntas como: ¿cuál es el estimado de la diversidad microbiana en ambientes cubanos?,
¿qué porcentaje y cuáles especies autóctonas están representado en nuestras colecciones?,
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¿cuáles son las especies microbianas amenazadas en el país? no tienen respuesta todavía.
La necesidad de conservar los genes microbianos para futuros estudios y explotación,
promueve la especialización de las colecciones de microorganismos en tareas de
aislamiento, mantenimiento, identificación y taxonomía de los cultivos, con el propósito de
lograr la autenticidad y confiabilidad de éstos.
En este trabajo nos propusimos incorporar bacterias marinas heterótrofas aisladas de la
Bahía de la Habana, evaluar algunas potencialidades biotecnológicas de las bacterias de la
colección, así como organizar y registrar la información asociada a éstas.
PC: microorganismos marinos
MATERIALES y MÉTODOS
Aislamiento y caracterización de bacterias marinas
Zona de Muestreo
Para el aislamiento de bacterias marinas heterótrofas se tomaron muestras de agua y
sedimentos en diferentes estaciones de la Bahía de la Habana (Fig. 1).
Figura 1. Estaciones de muestreo para el aislamiento de bacterias marinas heterótrofas en la
Bahía de la Habana
Los muestreos se realizaron en el mes de enero de los años 2001 y 2002. El procesamiento
de las muestras se realizó durante las primeras horas de la colecta.
Procesamiento de las muestras
En el caso de los sedimentos, bajo condiciones asépticas se tomaron 50g de muestra en
Erlenmeyers estériles a los que se añadió agua de mar estéril (450 mL), posteriormente
fueron incubados durante 15 min. a 30 °C y 125 r m
-1
en zaranda orbital rotatoria. Luego se
realizaron diluciones seriadas en agua de mar estéril
Para las muestras de agua se realizaron diluciones seriadas en agua de mar estéril.
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Aislamiento de microorganismos marinos
Las diluciones seleccionadas se inocularon a razón de 100µL por placa con medios
específicos
para bacterias marinas
.
Las placas fueron incubadas a 30 °C por 24 horas.
Para el aislamiento de bacterias marinas degradadoras de petróleo se utilizó la técnica de
Enriquecimiento (Zobell, 1973; Solanás, 1985) en medio salino descrito por Vela y Ralston
(1978) y se emplearon como fuente de carbono el petróleo venezolano Santa Bárbara de 34
API. Las diluciones de los cultivos de 21 días de incubación se inocularon a profundidad en
medio agarizado No. 6 (Gorvienko, 1961).
La selección de las colonias se realizó teniendo en cuenta las características culturales de
las mismas en cada medio de cultivo. Estas colonias se aislaron por agotamiento en placas
con medio de aislamiento para cada grupo fisiológico de interés. Se realizó la verificación de
la pureza basándose en criterios morfológicos-culturales y observaciones al microscopio
óptico.
Conservación de las cepas de la colección
La conservación de las bacterias heterótrofas aisladas se llevó a cabo en el medio No. 6
(Gorvienko, 1961), a través del método de subcultivos bajo aceite mineral estéril,
almacenados en refrigeración, por triplicado.
Los microorganismos aislados fueron depositados en la Colección de Microorganismos
Marinos del Instituto de Oceanología.
Búsqueda de sustancias de interés biotecnológico
A partir de cultivos puros obtenidos en medio No. 6 agarizado, se prepararon suspensiones
de células para las determinaciones de antibióticos, sustancias intercalantes de ADN,
hemólisis y degradación de petróleo, así como caldos fermentados para la producción de
biotensioactivos.
Ensayo de susceptibilidad antibiótica
Para la detección de bacterias productoras de metabolitos antimicrobianos se emplearon
cepas Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella
pneumoniae y Serratia marcescens Candida albicans, Cryptoccocus neoformans y
Aspergillus Níger.
Las bacterias patógenas utilizadas en el ensayo de susceptibilidad se inocularon en caldo
Mueller-Hinton. Todos los cultivos fueron incubados a 37 °C durante 24 horas. Los cultivos
fermentados se ajustaron entre 0.08-0.1 de absorbancia a una longitud de onda de 650 nm.
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Seguidamente se tomaron 100 µL como inóculo para placas con medio agar nutriente.
Los caldos inoculados con las suspensiones de células de levaduras se leyeron en
espectrofotómetro a una longitud de onda de 650 nm y se ajustaron a 40% de tramitancia. Se
tomaron 100 µL de las suspensiones ajustadas y se inocularon en 25 mL de medio agarizado
Sabouraud-Dextrosa y fue vertido en placas Petri.
Las suspensiones fúngicas (esporas o talos fragmentados) se inocularon a profundidad (50
µL) en placas Petri con medio Agar Papa-Dextrosa fundido.
La detección de la actividad antibiótica para actinomicetos se determinó por el método de
difusión en placas Petri con agar. Se emplearon discos de papel de filtro (Whatman # 3) de 6
mm de diámetro con los cultivos a evaluar, dispuestos equidistantes en una placa con una
capa de agar y el microorganismo sensible inoculado a profundidad (Peña, 1997).
Para el caso de las bacterias heterótrofas estas determinaciones se realizaron por el método
de réplica en placa, a partir de suspensiones de células en caldo nutriente.
Se dejó difundir durante 1 hora el caldo o suspensión de células en refrigeración y
posteriormente las placas fueron incubadas según los requerimientos de cada
microorganismo revelador para realizar las lecturas del tamaño del halo de inhibición de
éstos. Los ensayos se realizaron por duplicado y se evaluaron con respecto al medio de
cultivo estéril.
Búsqueda de sustancias intercalantes de ADN
Para determinar la producción de sustancias intercalantes de ADN como posibles agentes
antitumorales de bajo peso molecular se siguió el método descrito por Steinberg y cols.,
(1985) modificado por Miravet y cols.,(1994). En el caso de los actinomicetos se realizó por el
método de difusión en placas y para las bacterias heterótrofas por réplica en placas.
Degradación de petróleo
La selección de cepas degradadoras de petróleo en agua de mar y dulce se realizó,
utilizando el medio salino agarizado con petróleo venezolano Santa Bárbara de 34 API como
fuente de carbono y energía. La evaluación de la actividad se realizó utilizando el método de
réplica en placa descrito por Ortiz y cols., (2002).
Producción de tensioactivos
La producción de tensioactivos se evaluó en cultivos fermentados libres de células, obtenidos
por centrifugación a 7000xg y 4
o
C durante 30 minutos, en una centrífuga Beckman J2-H5
(USA). El medio de cultivo utilizado incluye sales inorgánicas y sacarosa como única fuente
de carbono y energía (Villaverde, 1997). Las determinaciones de tensión superficial e interfa-
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cial vs Diesel se realizaron por el método de anillo de Du No
ü
y (Duvjak y cols., 1985) en un
tensiómetro Krüss K 10 T de fabricación alemana.
Actividad hemolitica
Esta actividad se determinó por el método de réplica en placa en medio Agar Sangre. Las
placas se incubaron a 30 °C por 24 horas y se evaluó la formación o no de halo de lisis
alrededor de la colonia.
Clasificación taxonómica
Para la identificación de las cepas de bacterias seleccionadas se realizaron las pruebas
morfológicas, culturales, fisiológicas y bioquímicas sugeridas en el Manual de Bergey del
1994.
Actualización de la Base de Datos de la Colección
La Base de Datos de la Colección de Microorganismos Marinos contempla los registros de
los cultivos. Ésta se creó desde Visual Basic 6.0 con formato de Access del paquete
Microsoft Office´97.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Aislamiento de bacterias marinas
En nuestro estudio fueron aisladas 51 cepas de bacterias heterótrofas a partir de muestras
de agua y sedimento marino, las cuales presentaron una gran variedad de formas, textura,
tamaño y color, con predominio de bacilos Gram- positivas.
Las cepas recién aisladas, después de la purificación, fueron clasificadas por sus
características morfológicas y bioquímicas, encontrándose que el 55% se clasificaron como
Bacillus sp. es importante señalar que en sedimentos se aisló el 80.4 % de las bacterias
encontradas en estos muestreos, posiblemente determinado por una mayor concentración de
nutrientes en comparación con la columna de agua (Núñez y cols., 2002). Además,
numerosos autores afirman que los sedimentos presentan gran abundancia de
microorganismos.
Desde los primeros estudios de microorganismos marinos, se ha podido constatar que la
mayoría de las bacterias de origen marino son Gram- negativas y que las Gram- positivas
corresponden a menos del 10% del total de la población microbiana en el ecosistema,
planteándose que la pared celular de las bacterias Gram- negativas está mejor adaptada
para sobrevivir en este medio.
Estos estudios, sin embargo, están basados en muestras tomadas de la columna de agua y
existen evidencias de que las bacterias Gram- positivas se encuentran en mayor porcentaje
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del total de la microflora marina, en sedimentos o sobre superficies (Fenical y Jensen, 1993).
Desgraciadamente, la mayoría de las investigaciones sobre las bacterias de origen marino
han sido enfocadas a las variedades Gram- negativas, y por ello, poco es conocido acerca de
la distribución y el papel ecológico de las bacterias Gram- positivas en los hábitats marinos
(Fenical y Jensen, 1993).
Los resultados demostraron que sólo se detectó la presencia de estos microorganismos
hasta la dilución 10
5
. No obstante teniendo en cuenta que la abundancia de microorganismos
en los sedimentos marinos se encuentra en el orden de 10
9
y que, según Amann y cols.,
(1995), el por ciento de microorganismos cultivables en este ecosistema es alrededor de 0.25
%, pudieran estudiarse otras variantes de medios de cultivo y temperaturas de incubación,
entre otros factores, que garanticen una mayor frecuencia de aislamientos.
Debemos señalar que los niveles de contaminación por hidrocarburos, metales y otros
elementos existentes en el área de muestreo, pudieron influir notablemente en esta baja
frecuencia de aislamientos. Además, los resultados evidencian que el 50 % de los cultivos
aislados eran degradadores de hidrocarburos, lo cual corresponde con el estado de la zona
de muestreo fuertemente impactada por hidrocarburos (Núñez y cols., 2002).
Todas las cepas recién aisladas fueron incorporadas físicamente a la Colección de bacterias
marinas y mantenidas en el medio No. 6 por el método de subcultivos bajo aceite mineral
estéril, considerándose como Banco maestro para este grupo; además se creó un Banco de
trabajo, mantenido en cuñas de agar nutriente, para viabilizar la evaluación de su
bioactividad.
Selección de bacterias productoras de sustancias bioactivas
De las 126 cepas evaluadas, 34 fueron capaces de inhibir el crecimiento de al menos una de
las cepas indicadoras (Fig. 2). De estos microorganismos 22 presentaron actividad
antibacteriana, 7 mostraron actividad antifúngica y 6 fueron capaces de inhibir el crecimiento
de bacterias y hongos.
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Figura 2. Porcentajes de cepas evaluadas con actividad antimicrobiana
De los resultados obtenidos en esta investigación se pudo constatar que para los
actinomicetos la actividad antifúngica fue ligeramente superior que la antibacteriana. Sin
embargo, esto difiere de lo reportado por otros autores (Mendoza 1997, Cárdenas 1998 y
Pérez 1998). Estas diferencias podrían estar dadas a que en sus investigaciones fueron
analizados otros grupos bacterianos y no actinomicetos.
De las 86 bacterias heterótrofas evaluadas sólo un 12.7 % presentó actividad antimicrobiana.
Estos resultados pudieran estar determinados por el uso de suspensiones de células en
caldo nutriente estéril para las evaluaciones y no caldos fermentados en un medio de
producción de estos compuestos. No obstante, estas evaluaciones se realizaron
anteriormente para el resto de las bacterias de la colección en las mismas condiciones. Los
resultados arrojaron que de 335 cepas aisladas de fuentes marinas cubanas, 185 (55%)
mostraron actividad antimicrobiana ante Bacillus subtilis ATCC 6633; Escherichia coli ATCC
8739; Candida albicansATCC 10231 y Aspergillus niger (Pérez, 1998).
En comparación con otros estudios, en esta investigación presentaron actividad
antimicrobiana un mayor número de cepas (27%), con excepción del estudio realizado por
Pérez (1998). En ambos casos, todas las bacterias evaluadas fueron aisladas de fuentes
marinas cubanas, lo cual evidencia el alto potencial biotecnológico de nuestra diversidad
microbiana marina.
De las levaduras y hongos utilizados, el más resistente fue Aspergillus niger. La gran mayoría
de las cepas que mostraron actividad antifúngica, la desarrollaron contra las 3 cepas
sensibles ensayadas. Este resultado concuerda con el obtenido por Pérez y cols., (1999),
donde se enfrentaron bacterias heterótrofas marinas con 4 especies de hongos fitopatógenos
y el 100% de las cepas evaluadas fueron capaces de inhibir el crecimiento de al menos 3 de
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ellos.
Los resultados de este estudio sugieren que las cepas marinas productoras de sustancias
antimicrobianas detectadas o sus compuestos antimicrobianos, podrían ser de interés para la
biomedicina y la agricultura. No obstante, el verdadero valor de estos microorganismos debe
esperar por una identificación precisa de la naturaleza de los compuestos responsables de
las actividades detectadas.
El 4.8% de las cepas estudiadas (126) tienen la capacidad de producir sustancias
intercalantes de ADN como posibles agentes antitumorales de bajo peso molecular.
Steinberg y cols., (1985) aseguraron que los compuestos con actividad intercalante de ADN
pueden presentar actividad antibiótica, de manera que además del halo de fluorescencia
alrededor de las muestras se observe un halo de inhibición en el crecimiento de la bacteria
luminiscente. Los resultados demostraron que las cepas evaluadas no presentaron actividad
antibiótica contra Photobacterium leiognathi.
Existe información acerca de la producción de agentes antitumorales a partir de
microorganismos marinos. Tapiolas y cols., (1991), aislaron de Streptomyces sp. marino, las
octalactinas A y B. Estos y otros estudios realizados en dicha temática, han sido recogidos
en los estudios de Fenical y Jensen (1993).
En cuanto al arsenal de sustancias antitumorales de origen microbiano marino, la literatura
especializada es bastante reducida, a pesar de que en los últimos años, la producción de
compuestos antitumorales por microorganismos ha cobrado mayor interés por el bajo costo
de su producción, por las ventajas del proceso fermentativo y además, por las posibilidades
actuales de la genética microbiana (Pérez y cols., 1995).
Los resultados de la actividad hemolítica de las cepas evaluadas arrojaron que el 14 %
presentó esta propiedad. El ensayo facilita la diferenciación de especies del género
Streptococcus, que permite una rápida clasificación taxonómica de estos microorganismos.
La detección de esta actividad constituye un método de selección de microorganismos
potencialmente productores de tensioactivos, ya que estos compuestos tienen la propiedad
de lisar los glóbulos rojos (Mulligan y cols., 1989). Por otra parte, aunque se ha comprobado
que muchos microorganismos que producen tensioactivos no lisan los glóbulos rojos, esta
técnica permite una rápida detección de estas sustancias (24 h), al compararse con
tamizajes basados en vías fermentativas a partir de sustratos hidrófobos, que necesitarían
largos períodos de incubación.
A partir de 11 cepas hidrocarbonoclastas de la colección y de las 51 aisladas en Bahía de la
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Habana se realizó la evaluación de la degradación de petróleo en agua dulce. Los resultados
de este ensayo demostraron que el 66.7 % de las cepas evaluadas degradan petróleo en
esas condiciones. Estos estudios constituyen los primeros pasos en el desarrollo de
bioproductos para el tratamiento de aguas dulces expuesta a contaminación por
hidrocarburos.
La búsqueda de productos, que faciliten la eliminación de hidrocarburos vertidos al medio
ambiente, se ha intensificado en los últimos años. En particular, las aguas de consumo
requieren especial atención por las implicaciones a la salud y otras esferas.
Es necesario señalar que las evaluaciones realizadas por el método de réplica en placa,
permitieron diagnosticar un mayor número de cepas simultáneamente (hasta 46, según la
actividad a evaluar), que el método de difusión en placas. Esto permitió un ahorro
considerable de recursos materiales y humanos.
A partir de 71 cepas que pertenecen a la colección se detectó que el 61 % producen
compuestos con actividad superficial exocelular a partir de sustratos hidrosolubles (Fig. 3).
Además, el 21 % es capaz de producir tensioactivos que disminuyen significativamente los
valores de tensión superficial e interfacial (<30 mN/m y <1 mN/m) con respecto al control
(45.7mN/m y 20.8 mN/m). La síntesis exocelular de estos compuestos permite conocer su
actividad superficial por un método directo, rápido y sencillo como la determinación de
tensión superficial e interfacial.
Figura 3. Porcentaje de cepas evaluadas con actividad superficial.

El interés por la búsqueda y obtención de tensioactivos de origen biológico se ha
incrementado
notablemente por las múltiples aplicaciones que éstos presentan en la industria como
detergentes, emulgentes, humectantes, inhibidores de corrosión, entre otras.
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A pesar de que la función fisiológica de los biotensioactivos obtenidos de sustratos
hidrosolubles no ha sido totalmente esclarecida, se conoce una gran variedad de
microorganismos productores en presencia de estas fuentes. La producción de
biotensioactivos en estas condiciones ha sido utilizada frecuentemente por la simplicidad del
proceso fermentativo y su fácil comercialización.
La evaluación de las actividades antimicrobianas, intercalante de ADN, hemolíticas,
producción de tensioactivos y degradación de hidrocarburos durante la ejecución de este
proyecto permitieron ampliar conocimiento sobre el potencial biotecnológico de las cepas en
la colección con respecto dichas actividades (Fig. 4).
intercalantes de
ADN
antimicrobianas
degradoras de
petróleo
tensioactivos
hemolíticas
Figura 4. Representación de las actividades biotecnológicas evaluadas de las cepas de la
colección
La figura 4 evidencia el potencial biotecnológico de las bacterias marinas de nuestra
colección, encontrándose cepas muy promisorias para cada actividad evaluada. Además el
31% presentan un amplio espectro actividades de interés para diferentes industria.
La búsqueda de sustancias bioactivas a partir de organismos marinos se incrementa por año,
debido a que han resultado más activas que las de origen terrestre. En particular los
microorganismos
juegan un papel importante por las posibilidades que brindan en la obtención de
tales moléculas.
Clasificación taxonómica
En la tabla I se muestran los resultados de la identificación de 5 de las cepas más
importantes
de la colección por sus potencialidades como degradadoras de hidrocarburos, productoras
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de tensioactivos, antibióticos, intercalantes de ADN, actividad proteolítica y otras. Estos
resultados muestran la diversidad deinformación genética que presentan los
microorganismos
de diferentes ecositemas marinos.
Tabla I. Clasificación taxonómica de 5 cepas de la colección
Las características bioquímicas y fisiológicas de las cepas estudiadas no coinciden 100%
con el fenotipo ideal en cada caso. Estas diferencias pudieran estar determinadas por el
origen
marino de las mismas, sometidas al estrés que este ambiente implica.
La mayor parte de los investigadores en microbiología marina encuentran gran dificultad para
identificar las bacterias de este ambiente pues la taxonomía bacteriana esta dirigida
principalmente
al servicio de la medicina, y los medios de diagnóstico introducidos comprenden
una serie de ensayos y evaluaciones limitados a estos microorganismos. Por estas razones
ha sido difícil para los investigadores desarrollar métodos de clasificación para ambientes
extremadamente variables como el marino.
Por otra parte el Manual Bergey contiene descritos una proporción pequeña de bacterias
marinas. Los métodos sugeridos son muy útiles para clasificar las bacterias marinas a nivel
de género por la sencillez de su uso aunque tiene el inconveniente de ser poco preciso. De
cualquier modo, en general, las pruebas para clasificación empleadas regularmente pueden
ser aplicadas a cepas marinas, sin embargo ciertas modificaciones son requeridas por
ejemplo:
en la concentración de NaCl del medio y temperatura de incubación (Pérez, 1997).
Actualización de la Base de Datos de la Colección
La Base de Datos de la Colección de Microorganismos Marinos se encuentra actualizada y
contempla los registros de los 396 cultivos de bacterias y 139 de hongos que conforman la
colección con una información detallada de los mismos. En el caso particular de las bacterias
también se incluyen las propiedades biotecnológicas consideradas en los tamizajes de
la colección.
La Base de Datos Factográfica brinda un medio factible para la captura de los datos, así
como,
las posibles consultas por los diferentes campos de ésta, proporcionando a su vez la
posibilidad
de emitir reportes de su contenido, de forma clara y amena. La figura 5 representa la caja
de diálogo de esta base de datos.
Figura 5. Ventana principal de la Base de Datos de la Colección de Microorganismos
Marinos.
CONCLUSIONES
»
La metodología de aislamiento empleada permitió incorporar 51 cepas de bacterias
marinas
hetrótrofas a la Colección de Microorganismos Marinos del Instituto de Oceanología
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(CITMA), de manera que constituyen un aporte importante al conocimiento de la
biodiversidad
de los ecosistemas marinos de Cuba.
»
Las evaluaciones de las potencialidades biotecnológicas de las bacterias marinas en
colección,
realizadas durante la ejecución del proyecto, permitieron completar los estudios
de tamizaje desarrollados por la colección con respecto a éstas. En estos momentos el
98% de esos cultivos presentan propiedades de interés para diferentes ramas de la industria
y el 31 % tiene un amplio espectro de potencialidades.
»
Se estableció la Base de Datos Factográfica de la Colección de Microorganismos Marinos
del Instituto de Oceanología, que incluye la información asociada a los cultivos en
colección

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